مقاله درمورد نرم افزار

آوري و پرورش ميزبان
براي اين منظور ابتدا بذر گوجه فرنگي در سيني هاي کشت که حاوي کوکوپيت بود کاشته، آبياري به مدت 3 هفته ،هرروز تا زماني که گياه به مرحله 2-3 برگي رسيد صورت گرفت. سپس آنها را به محيط کشت اصلي که همان گلدانهاي پلاستيکي است منتقل شدند.گلدانها در محيط ايزوله که با شرايط دما،نور و رطوبت مناسب بود نگهداري شدند.خاکي که براي گلدان ها استفاده شد ، ترکيبي از خاک باغچه،خاک برگ و کوکوپيت به نسبت مساوي بود.
آفت از گلخانه هاي آلوده در اطراف اصفهان (فولادشهر) و گلخانه هاي آلوده مغان جمع آوري شد.
تمام آزمايشات اين تحقيق در آزمايشگاه انجام شد.
بوته هاي آلوده به مينوز گوجه فرنگي جمع آوري و به آزمايشگاه منتقل شدند و سپس درون ظرف هاي پرورش در شرايط کنترل شده و در درجه حرارت°C1±25و رطوبت نسبي 50-60? و در محيط سالم و عاري از هر گونه آلودگي قرار داده و سپس شفيره هاي حاصل جمع آوري و به ظروف مخصوص تخم گيري که شامل ظروف پلاستيکي استوانه اي با قطر25 و ارتفاع 20 سانتي متر منتقل و روي آن توري با مش ريز کشيده شده تا جلو خروج حشرات کامل را از ظرف بگيرد و از طرفي تهويه لازم را ايجاد نمايد.سپس يک کاغذ صافي بر روي تورها جهت تخم ريزي اين حشره قرار داده شد و مجددا تخم هاي استحصالي بر روي بوته هاي گوجه فرنگي کشت شده سالم منتقل و سيکل پرورش تکرار گرديد.تغذيه حشرات کامل پروانه مينوز گوجه فرنگي توسط بوته هاي گوجه فرنگي و محلول قندي 20?آب عسل رقيق انجام گرفت.

1-3) تغذيه لارو از برگ (عکس اصلي)

شکل 2-3) نحوه انجام آزمايش و شمارش لاروهاي مرده در پتري ديش(عکس اصلي)

شکل 3-3) جدا سازي لارو از بوته هاي آلوده جمع آوري شده(عکس اصلي)
3-2)قارچ هاي بيمارگر
-3-2-1) جمع اوري وشناسايي قارچ
دراين بررسي دوگونه قارچ بيمارگرحشرات Metarhizium anisopliaeو Beauveria.bassianaو باکتري Bacillus thuringiensis مورداستفاده قرارگرفت که گونه اول ازدانشکده کشاورزي دانشگاه گيلان(رشت) و گونه دوم ازموسسه تحقيقات گياه پزشکي کشور(تهران) و باکتري به صورت تجاري تهيه شد.
درآزمايش هاي ارزيابي کارآيي اين عوامل، درصد مرگ و ميرلاروهاي مينوزگوجه فرنگي باغلظت هاي مختلف اين پاتوژنها مقايسه شدند.

3-2-2) کشت و نگهداري جدايه هاي قارچ
براي توليد کنيدي به مقدارزياد ازمحيط کشت هايي استفاده مي شود که با دارابودن محيط اسيدي ازرشد باکتري هاي ساپروفيت جلوگيري نموده و باعث توليد هاگ به اندازه کافي ميشود.
جهت تهيه محيط کشت65 گرم پودر آگار و 10گرم عصاره مخمر در يک ليتر آب مقطر يا39 گرم ازپودرآماده در يک ليتر آب مقطرحل کرده ودربن ماري قرارداديم. پس ازحل شدن کامل مواد درآب ، مجموعه داخل اتوکلاو به مدت 15 دقيقه درفشار 5/1 اتمسفرو دماي 121درجه سانتي گراد استريل شده وسپس درزيرهود لامينار درون تشتک سترون ريخته مي شد.سوسپانسيون غليظي ازجدايه ها تهيه وازپارچه ململ4 لايه عبورداده شده تا ميسيليوم هاي آن جداگردد. زهراگيني قارچ دراثر کشت هاي متوالي درمحيط کشت مصنوعي کاهش مي يابد.

شکل4-3) قارچ B.bassiana(سمت چپ)، قارچ M.anisopilae (سمت راست)
-3-2-3)تهيه سوسپانسيون هاگ
تعيين غلظت سوسپانسيون توسط لام هموسيتومتر(لام گلبول شمار) ساخت شرکت نيوبائر وميکروسکوپ متباين يا فازکنتراست413 B*ساخت شرکت اليمپوس انجام ميگرفت .جهت انجام اين کاردريک محيط استريل 100ميکروليترازسوسپانسيون اصلي توسط ميکروپيپت ياسمپلربرداشته شده و با آب مقطر به ميزانn10برابر رقيق شده و آنگاه10ميکروليترازاين محلول رقيق شده برروي سطح موردشمارش روي لام هماسيتومترريخته شد وروي آن يک لامل تميزقرارميگرفت .پس ازگذشت 5دقيقه که حرکت کنيديهاکم شدتوسط ميکروسکوپ فازکنتراست بابزرگنمايي 40 تعدادکنيدي ها شمارش ميشد.براي شمارش تعداد کنيدي ها5مربع بزرگ موجوددرقطرموردشمارش قرارميگرفت.اين کاربراي هرنمونه سه بارانجام گرفته وميانگين شمارش هامحاسبه ميگرديد.درپايان ميانگين مجموع کنيديهاي 5مربع درفرمول زير(3-1)جايگزين شده وغلظت کنيدي به ازاي ميلي ليترسوسپانسيون اصلي محاسبه ميگرديد.
(فرمول3-1)
درفرمول فوق X ميانگين مجموع کنيدي هاي شمارش شده در5مربع در3 تکرار وYمجموع کنيدي هاي موجوددريک ميلي ليترسوسپانسيون اصلي فارچ مي باشد.درصورت رقيق کردن سوسپانسيون، جهت تعيين غلظت بدست آمدهغلظت قبلي درفاکتورترقيق(D=10n)ضرب ميگردد(Erwin,1985). عدد5 نشانگرتعدادمربعات بزرگ مورد شمارش درقطرلام وعدد16بيانگرتعدادمربعات کوچک موجوددرهرمربع بزرگ مي باشد. مقدار 2*10-7 نيز مقدار ثابت Kاست که باتوجه به ويژگي لام هموسيتومترتوسط سازنده محاسبه گرديده ودرفرمول جايگزين شده است.

درصورتي که سوسپانسيون پايه اي که تعيين غلظت مي شد داراي غلظت کافي بودمي توان ازطريق رقيق کردن متوالي وبا استفاده ازفرمول زير(فرمول 3-2)غلظت هاي پايين تررابدست آورد.
(فرمول3-2) N1V1=N2V2
ولي درصورتي که سوسپانسيون پايه تهيه شده رقيق باشدمي توان بااستفاده ازسانتريفيوژ کردن ان راتغليظ کرد.براي انکه عمل تغليظ انجام شود محلول در14000دوردردقيقه(rpm) به مدت 10دقيقه سانتريفيوزميگرديد.انجام عمل تغليظ تارسيدن به غلظت مورد نياز ادامه پيداميکرد.
هاگ هاي تشکيل شده درمحيط کشت بوسيله يک سوزن سرنيزه اي خراشيده شده درشيشه مک کارتي داراي 1/0±1سي سي آب مقطر قرارداده شدند. سپس براي 3-2دقيقه بوسيله vortex کاملامخلوط گرديدند. سوسپانسيون پس ازعبورازپارچه ململ 4لايه سترون درشيشه مک کارتي جمع اوري شده وبه شدت تکان داده شدبطوريکه درنهايت يک مخلوط يکنواخت بدست امد. سوسپاسيون مربوط به قارچB.bassiana به رنگ سفيدشيري وقارچ M.anisopliaeبه رنگ سبز زيتوني ميباشد؛ سوسپانسيونيکه به اين صورت تهيه ميشد اماده تعيين غلظت بود.

شکل 5-3) نحوه تقسيم بندي يک لام هموسيتو متر

شکل 6-3 ) نحوه استفاده از لام هموسيتومتر

شکل 7-3) نحوه تهيه سوسپانسيون قارچ B.bassiana(سمت راست)، قارچ M.anisopilae(سمت چپ)
3-2-4) آزمايش زنده ماني
قبل ازاستفاده ازسوسپانسيون موردنظرازمايش زنده ماني کنيديوم ها انجام گرفت. 100µl از سوسپانسيون رقيق به صورت قطره قطره در سطح تشتک آب آگار ريخته و پتري بصورت دوراني حرکت داده شد تا سوسپانسيون کاملا پخش شد. سپس اطراف تشتک را با پارافيلم پوشانده و در انکوباتور25 درجه سانتي گراد به مدت 18-16 ساعت قرارداده شد. زير ميکروسکوپ در 3 تکرار 100 کنيدي بطور تصادفي شمارش شد و بافرمول زير (فرمول3-3) درصد قابليت زيست آنها محاسبه شد.

فرمول3-3

3-3) روش زيست سنجي
به منظور برآورد ميزان بيماريزايي قارچ هاي B.bassiana وM.anisopliaeو باکتري Bacillus thuringiensis (فرم تجاري) از روش زيست سنجي غوطه وري استفاده گرديد. به اين صورت که بعد از تهيه غلظت هاي مورد نظر ، براي هر تيمار تعداد 20 لارو سن1 و سن 3 به وسيله غوطه ور سازي آنها به مدت 5 ثانيه در سوسپانسيون قارچي و باکتري B.t تيمار شدند. لاروهاي شاهد در آب مقطر حاوي3 Teewn80? غوطه ور شدند.حشرات تيمار شده به داخل پتري ديش هاي حاوي کاغذ صافي منتقل شدند.کاغذ صافي باعث جذب آب اضافي شده و نيز احتمال جذب کنيدي ها را به وسيله حشره افزايش مي دهد.(Adaneet al ,1996)
حشرات تيمار شده پس از گذشت 6 ساعت به پتري ديش هاي حاوي چند برگ گوجه فرنگي منتقل و در دماي °C2±25 و رطوبت نسبي 5±80%و دوره نوري 16 ساعت روشنايي و 8 ساعت تاريکي در داخل انکوباتور نگهداري مي شدند.شمارش تلفات با فواصل زماني 24 ساعت وتا 7 روز ادامه يافت.
3-6) روش تجزيه وتحليل داده ها
پس از ثبت داده هاي مرگ ومير ابتدا درصد مرگ ومير تصحيح شده (cm%) با استفاده از فرمول ابوت بدست آمد.
فرمول Abbott:
M1: درصد افراد مرده در تيمار
Mc: درصد افراد مرده در شاهد
CM% : درصد مرگ و مير تصحيح شده
آزمايشات در قالب طرح کاملا تصادفي انجام شد.تجزيه واريانس ها و مقايسات ميانگين تيمارها با استفاده از آزمون دانکن در سطح 5? و با نرم افزار SAS محاسبه شد و براي رسم نمودارها از نرم افزار Excle استفاده گرديد.

3-7) آزمايشات اوليه تعيين غلظت هاي محدوده LC50
جهت انجام اين آزمايش غلظت هاي مختلف قارچM.anisopliae وB.bassianaو باکتري B.t روي لارو هاي سن1 و سن3 بطور جداگانه طبق جدول زير بکار برده شدند و آمار مرگ و مير تا هفت روز ثبت شد.

رديف
عامل بيولوژيک
غلظت
1
B.bassiana
10^8 اسپور
2
B.bassiana
10^6 اسپور
3
B.bassiana
10^4 اسپور
4
B.bassiana
10^2 اسپور
5
B.bassiana
10^1 اسپور
6
M.anisopliae
10^8 اسپور
7
M.anisopliae
10^6 اسپور
8
M.anisopliae
10^4 اسپور
9
M.anisopliae
10^2 اسپور
10
M.anisopliae
10^1 اسپور
11
B.t
1500 ppm
12
B.t
1000 ppm
13
B.t
500 ppm
14
B.t
250 ppm
15
B.t
125 ppm
16
B.t
60 ppm
17
شاهد
—–
جدول 2-3) تيمارهاي قارچي و باکتريايي بکار رفته در آزمايشات اوليه
باتوجه به آمار مرگ ومير در غلظت هاي مختلف با استفاده از برنامه probit ،مقدار اوليه LC50را محاسبه کرده و با بکار گرفتن دو غلظت بالاتر و پايين تر آن آزمايشات بعدي با غلظت هاي نزديک به محدوده LC50 انجام شد و مقدار دقيق محاسبه گرديد.(جدول ضميمه)
ميزان LC50 قارچ B.bassiana براي لارو سن 1، 5.7*108 اسپور در ميليليتر و لارو سن3 ،108*9.4 اسپور در ميليليتر ،قارچ M.anisoiplae ،لارو سن1،107*5.8 اسپور در ميليليتر ،لارو سن3 ،108*4.27 اسپور در ميليليتر و باکتري Bt ،لارو سن 1، 1.5ليتر در هزار ، لارو سن3 ،2 در هزار ليتر بدست آمد. بر اساس اين مقادير غلظت ها براي آزمايش نهايي محاسبه ش
فصل چهارم
يافته هاي پژوهش
1-4)ارزيابي اثر قارچ M.anisopliae بر روي لارو سن 1 پروانه مينوز گوجه فرنگي
مرگ و مير لاروهاي سن 1 پروانه مينوز گوجه فرنگي در غلظت هاي متفاوت تا زمان 4 روز بعد از تيماراندازه گيري شد.
نتايج بدست آمده از مقايسه ميانگين ها نشان ميدهد که بيشترين تلفات لاروهاي سن 1 پروانه مينوز گوجه فرنگي در برابر قارچ M.anisopliaeبا غلظت 1014×3/4اسپور در ميلي ليتر به ميزان 80? در روزچهارم بعد از تيمار ايجاد گرديده است.از روز پنجم از خاصيت زهرآگيني قارچ کاسته شد.

غلظت / زمان
2 روز(48 ساعت)
4 روز(96 ساعت)
1
3?
6?
2
6?
16?
3
26.6?
53.3?
4
40?
63.3?
5
56.6?
80?
جدول 1-4) ميانگين درصد مرگ و مير لاروهاي سن 1 مينوز گوجه فرنگي
غلظت
1
2
3
4
5
مقدار(اسپور درميلي لينر)
0.8*108
104*7.4
107*5.8
1010*3.9
1014*4.3
جدول 2-4) مقدار غلظت هاي قارچ M.anisopliae براي تيمار لارو سن 1 پروانه مينوز گوجه فرنگي

نمودار1-4) مقايسه درصد مرگ وميراصلاح شده لارو هاي سن 1 پروانه مينوز گوجه فرنگي در اثر قارچ M.anisopliae

برآورد پارامتر ها

Parameter
Estimate
Std. Error
Z
Sig.
95% Confidence Interval

Lower Bound
Upper Bound
PROBITa
VAR00001
.084
.050
1.701
.089
-.013
.182

Intercept
-.329
.243
-1.353
.176
-.572
-.086
a. PROBIT model: PROBIT(p) = Intercept + BX (Covariates X are transformed using the base 10.000 logarithm.)

تست اسکوار

Chi-Square
dfa
Sig.
PROBIT
Pearson Goodness-of-Fit

دیدگاهتان را بنویسید